倾转序列采集
断层图由样品在一系列倾转角下拍摄的多张二维投影构建而成。
倾转序列 (tilt series) 是电子断层成像的原始数据：对同一样品区域拍摄的一组二维投影图，每张对应电镜样品台的一个不同倾角。让样品相对电子束旋转，便从多个方向暴露物体，这些视角随后在重构中合并为一个三维体。
贯穿全篇的一个事实是：每张图都是一次投影——电子束沿其路径把样品的散射密度积分起来，将一个三维物体压成一张二维平面。单张投影分不清靠近冰板上表面的特征和靠近下表面的特征，深度信息没了。倾转把深度找回来，方式和双眼测距一样：每个新角度都是一条新的视线，而某个特征在不同视角间的位移多少，取决于它埋得有多深。重构就是对这一位移的反演。所以设计一条倾转序列，本质上就是设计把有限的剂量花在哪些视线上。
设想给一块磨砂玻璃镇纸拍照，里面悬着几个小物件。单张照片把一切压到一个平面上，你说不清谁在前谁在后。绕着它走四分之一圈、边走边拍，内部物件在相邻照片间的相对移动就泄露了它们的深度——近的物件在画面里大幅扫过，远的几乎不动。倾转序列正是这趟绕行，只不过是样品在转、相机不动，而且有两条硬约束咬住不放：你只能绕过去一部分（缺失楔形），而每拍一张都会损伤样品一点，所以你总共只拿得到几十张，且每张都既暗又糙。
剂量分摊的权衡 —— 调节倾转张数 N：
样品在辐射损伤前只能承受固定的总电子剂量。把它分摊到 N 张倾转图，每张剂量 ∝ 1/N，于是每张的噪声 ∝ √N。张数太少：每张干净，但角度采样稀疏、出现条纹；张数太多：采样致密，但每张淹没在噪声里。最佳点在两者之间。
可达到的角度范围受几何限制。样品台倾斜时，电子束穿过冰板的路径约按 拉长，因此高倾角下有效样品厚度增大，直至电子无法穿透。这里 是从未倾转（水平）位置量起的倾角， 是它的余弦；在 时该因子为 ，在 时为 ，在 时约为 。于是一块 200 nm 的冰板，在 下呈现的有效厚度约 400 nm、在 下近 600 nm——再往上，电子散射太剧烈，已带不出可用衬度。样品台硬件与支撑载网还会施加额外限制。实际采集一般止于 ±60° 至 ±70°，角度步长为 1–3°，约得 40–60 张投影。从未到达的角度构成缺失楔形，这是断层几何最重要的伪影。
由于样品只能承受有限的总电子剂量，这点预算必须分摊 (fractionated) 到整条序列上。设可承受的总剂量为 、共拍 张，则每个倾角大约只分到 ，于是每张投影都极其嘈杂，重构一开始面对的就是低信噪比的数据。这里 是玻璃态样品在辐射损伤毁掉你想成像的高分辨信息之前所能吸收的累积曝光量——单位是每平方埃的电子数（）——而 是倾转张数。这两个旋钮相互拉扯：倾角越多（ 大），角度范围采样越细、留给重构去内插的空隙越小，但每张图分到的剂量片 越薄、也就越嘈杂；倾角越少则每张越干净，却留下更粗的角度空隙。上面的演示让你能直接体会这一点——没有免费午餐，只有一份预算要分配。
这正是断层数据难啃的根本原因。单颗粒成像往往把整份剂量预算花在一张照片上；这里却把同一份预算切成 40–60 片，所以单张倾转图的信噪比可能落在 1 量级甚至更低（见信噪比）。你想要的结构在每一帧里都被幅度相当的噪声埋着，只有把许多嘈杂视角合起来、再借子断层平均的冗余之后，它才显现出来。
倾角的采集顺序很重要，因为辐射损伤是累积的。剂量对称 (dose-symmetric) 方案先采集低倾角视角——此处样品最薄、信息最宝贵——再以对称模式向外交替推向更高倾角。这样把早期、未受损的剂量给到最约束高分辨结构的角度，而把后期带损伤的曝光分摊到角度范围的边缘。
要看清顺序不是细枝末节，可把它和更早的替代方案对照。朴素的单向 (unidirectional) 方案从 一口气扫到 ；扫到另一端时样品几乎已吸完整份剂量，于是整整一侧的角度范围都是在受辐射损伤的样品上拍的，只贡献模糊的低分辨信息。双向 (bidirectional) 方案从 出发先到一端，再回到 去另一端——好一些，但它仍在中心倾角处给累积剂量引入了一个不连续，给对齐添麻烦。剂量对称方案（常写成 这样的分组模式）让累积剂量成为倾角的一个平滑、对称的函数，并把珍贵的早期电子前置到承载最高分辨信号的、近轴的薄视角上。代价是每条序列要做更多次样品台移动与稳定等待，所以它是在样品台稳定性与自动化改善之后才变得实用。
序列中需追踪若干效应。每张图在受控的欠焦量（离焦, defocus）下拍摄，它决定衬度传递函数（见 CTF 一节）。样品台在倾角之间移位、样品漂移并形变，因此各帧从不完美对齐。校正这些位移正是倾转序列对齐的工作，须在重构之前完成。剂量受限采集固有的低信噪比，也正是 CryoGEN 等学习型复原方法的动机：当每一帧都这么嘈杂时，如何恢复底下的密度就成了一个统计推断问题，而不只是滤波问题。
逐图 CTF 与离焦
一条倾转序列并无单一离焦值。电镜设定一个名义欠焦量，但样品台倾斜后，高倾角图像中不同位置沿电子束方向处于不同高度，焦面便在视场上变化。因此每张投影都有各自的衬度传递函数，而且在高倾角下，同一张图内部的 CTF 还会随位置变化。估计离焦因此自成一步，需要逐倾角进行，最严苛的工作中甚至要沿倾斜图像逐条带估计：CTF 会在依赖离焦的空间频率处翻转衬度，只有先校正过来，这些频率才能在重构中相干合并。整套数据的离焦也会被刻意错开，让一张曝光的 CTF 零点由另一张来补齐。
这套几何值得具体想象一遍。样品台水平时，整个视场处于同一名义高度、共享一个离焦值。倾到 ，视场就变成一道斜坡：距倾转轴水平 处的一点，沿电子束方向有一个 的高度偏移，于是它的离焦比轴上值差出同样的 。在 下，一个偏离轴 1 µm 的特征已经偏离名义焦面几百纳米——这个离焦差大到足以把 CTF 零点挪到不同位置。这正是为什么高倾角图像必须沿平行于倾转轴的条带来做 CTF 建模：每个条带高度大致恒定、离焦也大致恒定，而把整张图当作一个均匀 CTF，会把远离轴的一切都校正错。
从剂量分摊到重构
剂量预算其实切分了两次。它先在 个倾角间分摊，每个角约得 ；而在单个倾角内部，曝光本身又由直接电子探测相机拍成一段含数个子帧的影片。之所以把曝光拆成帧，是为了在它们叠加成一张投影之前，先追踪并校正电子束诱导运动 (beam-induced motion)——即样品刚受照时，随电荷累积、支撑膜松弛而发生的整体漂移与局部形变。典型像素尺寸在数埃量级，具体取决于在可用剂量下分辨目标所需的放大率。每张投影对齐并计入 CTF 后，都会标注各自的累积剂量，好让受辐射损伤的高频得以降权——这些投影正是重构反投影或迭代拟合成三维体时的输入。
逐帧的剂量标注值得多说一句，因为它正是流程协调两个对立事实的方式：低空间频率（整体形状）很扛辐射损伤，而高空间频率（精细细节）在曝光早期就被抹掉。剂量加权 (dose weighting) 用每一帧的累积剂量施加一个既依赖频率又依赖曝光的滤波——高频只从早期、未受损的帧里保留，后期的帧只在粗糙、抗损伤的信号上才被信任。再配合上文的剂量对称顺序，这意味着最终断层图的高分辨信息主要来自低倾角、早曝光的视角，正是样品最薄、最新鲜的地方。整套采集设计——角度范围、步长、倾转顺序、分帧、剂量标注——都是一项协调一致的努力：把固定的剂量预算花得让承载最多可恢复信息的视角，恰好在最佳条件下被记录下来。
本页讲的一切，都夹在流程里上下两个相邻环节之间。上游，样品已按冷冻电镜与玻璃化所述完成玻璃化、电镜也已架好；倾转序列就是那块冷冻样品被转化成的东西。下游，这些嘈杂、各自对齐过的投影，由对齐配准、再经重构合并成三维体——缺失楔形、剂量噪声、逐倾角 CTF 全都被烙进那个体里，成为后续复原与平均必须应对的伪影。