金颗粒对齐
重构前必须把每张倾转图对到同一三维坐标系 —— 用金颗粒做基准点，或无标记的图块追踪
倾转序列采完，你手里是一摞二维图，但它们彼此并不”对齐”：样品台在每个倾角之间有机械回程间隙，电子束诱导的运动又让样品在曝光过程中漂移、形变。每张图都带着各自未知的面内平移、旋转和放大率误差。直接拿这摞图去反投影，不同倾角的射线不会交于同一点，整个体会糊成一团。对齐 (alignment) 就是在重构之前，求出每张图的几何变换，把它们都映到同一个三维坐标系里。这一页讲实际怎么做；背后的几何模型见倾转序列对齐。
这一步在管线里接在数据处理（CTF 与剂量加权）之后：你已经有了一摞运动校正、估好 CTF 的倾转图，进来的是这摞图，出去的是一组逐图的几何参数，做这件事的标准工具是 IMOD 的 etomo（无标记情形则是 AreTomo）。
想象样品里钉着几颗不动的小亮点。如果倾转几何完美，每颗点的投影会随倾角描出一条可预测的曲线。实际曲线对理想曲线的偏离，就是这一帧视场到底漂了多远的直接测量。把几颗点合起来，就能反解出每张图该怎么挪、怎么转——这就是金颗粒对齐的全部思路。
为什么必须对到同一个坐标系
反投影的前提是：知道每张图是从哪个方向、对准空间里哪个点拍的，才能把它沿那条射线”抹回”体内。如果第 17 张图实际上比模型以为的位置偏了几个像素，它那条射线就会落在错误的地方；和其它倾角的射线本该在某个特征上交汇，现在却交不上。结果就是这个特征被涂抹成一团模糊。每张图都带一点这样的误差，叠起来整个体就糊了。所以对齐要解决的，是给每张图都找出一套变换，让所有倾角的射线重新指向同一个三维坐标系里的同一批点。
金颗粒做基准点
最稳的办法是在冷冻样品前往悬液里掺入胶体金颗粒 (colloidal gold)，直径约 5–10 nm。金的散射截面远大于生物物质，所以在每张投影里都是清晰的暗点——高衬度、点状、各倾角都认得出。它们就是贯穿整条序列的基准点 (fiducial marker)：因为是同一批不动的物理点，它们在不同倾角里的投影位置就把各张图绑到了一起。
基于金珠的对齐（典型实现是 IMOD 的 etomo 流程）按下面的顺序走：
- 粗对齐 (coarse alignment)：先不管金珠，直接对相邻倾角两两做互相关，把明显的大平移抹掉，让这摞图大致叠齐。这一步只是给后面的追踪一个干净的起点——珠子不会在帧间跳得太远。
- 撒种与追踪 (seed & track)：在零倾角（最清晰）那张图上自动检测金珠，挑一组分布均匀、不重叠、不在视场边缘的珠子作为种子；然后把每颗珠子在整条倾转序列里跟下去，记录它在每个倾角下的实测投影坐标。追踪容易在高倾角处断——珠子衬度变弱、互相靠近——这些断点通常要回到 3dmod 里人工补上或剔除。
- 求解 (solve)：用所有珠子的轨迹，联合拟合每张图的几何参数。目标是最小化重投影误差 (reprojection error)：假设有一组三维珠子坐标和一套逐倾角变换，把三维珠子按这套变换投影回二维，应当落在实测位置上。优化器同时调整三维珠子模型和所有图像的变换，让两者的差异最小。
- 看残差 (inspect residual)：求解吐出一个残差数字（下一节细说）。看总残差、也看每颗珠子的单独残差，把追错的坏珠子删掉，重解，直到残差稳定下来。
跑完这四步，etomo 就握有了把每张图放回体内所需的全部几何参数。
求解出来的到底是什么
每张图拿到的不只是一对平移。完整模型给每张投影都配上：
- 、 方向的面内平移——纠正视场移位；
- 一个面内旋转；
- 一个放大率项——补偿倾转过程中聚焦/高度变化带来的微小缩放。
这些都以一个全局的倾转轴角 (tilt-axis angle) 为基准（旋转轴在探测器平面里的朝向），倾角本身也一并精修——样品台读数往往和真实几何差一点。关键在于这些参数是联合求解的，而不是相邻图两两配准。逐对配准的小误差会沿序列累积，最后变成整条序列的系统性扭曲；一次性全局拟合才能把误差摊开、互相约束。
求解的核心数字是残差 (residual)：实测珠子位置与拟合模型重投影位置之差，通常报成所有珠子、所有倾角上的均方根（单位是像素或纳米）。残差直接给出对齐质量。
什么叫好、什么叫坏，定性上看得出来。好的对齐：总残差在亚像素量级（典型采集下大致零点几像素到一像素出头），每颗珠子的残差彼此接近、没有谁特别离群，残差的方向向量散点看上去是随机的小云团、没有系统性的朝向。坏的对齐：总残差好几像素；某一两颗珠子残差远大于其余（追踪在某个倾角跳到了邻珠或噪点上）；或者残差向量整体指向同一方向、随倾角规律变化——这说明不是随机噪声，而是几何模型本身没拟合对（倾转轴角错了、或缺了某个该开的参数）。实践中先盯离群珠子：删掉它们重解，总残差常常立刻掉下来；如果是系统性朝向，则要回去检查倾转轴和求解选项。
残差为什么决定分辨率：重构按拟合几何把每张图放回体内，一个特征若真实位置偏离模型哪怕只偏了高分辨步长的一小部分，来自不同倾角的射线就不再重合，特征弥散成模糊。最先丢的是高空间频率——射线必须在那里最精确地重合。所以残差是下游一切分辨率的硬上限，子断层平均再怎么平均也补不回对齐阶段丢掉的高频。
无标记对齐
撒金珠并不总可行：原位 lamella 样品没法掺珠，珠子也可能正好压住感兴趣的区域。无基准点 (fiducial-less) 对齐改为直接拿样品自身的内容来配准。
最常见的是图块追踪 (patch tracking)：把每张投影切成许多小块，在相邻倾角之间对每个小块做互相关，用图像本身的特征代替金珠，照样累积出逐倾角变换。投影匹配类方法则借一个临时重构反复迭代精修。AreTomo 等工具走的就是这条路，速度常常快到能边采集边对齐，还能顺带做局部形变校正。代价是：没有金珠那样干净的高衬度锚点，无标记对齐在极薄、低衬度或特征稀少的样品上更容易失稳，结果也更依赖样品内容是否够”花”。一个实用的判断：如果你的样品里本来就有金珠，就用金珠对齐——它几乎总是更准；只有在掺不了珠、或珠子挡住目标时才退到无标记。
接到重构
对齐的输出是一组精修后的几何参数——逐图变换、倾转轴朝向、校正后的倾角。它们直接喂给加权反投影 (WBP) 或迭代重构（在 etomo 里就是 tilt 那一步），把这摞二维图叠成三维断层体。注意对齐不能填补缺失楔形：它只是把已经采到的角度对齐好，那段从没采到的倾角对应的傅里叶空缺仍然空着，得靠 CryoGEN / CryoWGEN 这类学习型先验去推断。换句话说，对齐决定了你能多忠实地用上已有数据，而缺失楔形决定了已有数据本身缺了多少。
上一步：数据处理：CTF 与剂量加权 · 下一步：从倾转序列到断层图